作为系列的最新续作，玩家在游戏中可以控制库巴进行游戏，这点极具创意。事实上，游戏中的马里奥兄弟与库巴是分为两线作战的：库巴负责在蘑菇国的大地图上行动，而马里奥兄弟则在库巴的肚子里展开冒险。在本作的故事中，蘑菇国的居民都患上了一种怪病,患者的身体会肿胀得像气球一样，导致生活不能自理。而马里奥兄弟的任务就是寻找致病的原因并设法得到解药。同前作一样，游戏中充满了有趣的解谜要素。并且，这些解谜要素还将马里奥兄弟在库巴肚子里的冒险与库巴在地面上的行动有机联系起来：马里奥兄弟通过在库巴体内的解谜，可以令库巴的各种能力逐步恢复，而库巴只有在恢复了这些能力之后，才可以将地面上的各种机关打通。另外，游戏中还存在将NDS横向放置才能进行的大魄力战斗场景。在中后期的某些战斗中，库巴的身体会巨大化，以对付诸如城堡之类的大型敌人。在这样的战斗中，还充分活用了NDS的触控机能以及麦克风，战斗的乐趣也因此大幅度提升。到了游戏后期，马里奥兄弟还是有机会回到现实世界之中的，只不过其中的戏份相对较少。美中不足的是，这款游戏中不存在多周目的设定，缺少了通关之后继续玩下去的必要性。